Reacción de la qPCR para Ántrax

Reacción de la qPCR para Ántrax 

1.     Se desarrollaron cebadores para la amplificación de un fragmento de 235 pb de la secuencia E4. Las sondas de hibridación dual se diseñaron con el software LightCycler Probe Design para evitar procedimientos de post-amplificación que consumen mucho tiempo. Las mezclas de amplificación contenían 2 μl de la mezcla 10X LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes, 3 mM de MgCl2 (concentración final), 0.5 μM de cada oligonucleótido, 0,25 μM de cada sonda de hibridación y 5 μl de ADN molde en un volumen final de 20 μl. 

2.      Después de una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min para activar la ADN polimerasa FastStart Taq, el perfil de amplificación de 45 ciclos consistió en calentar a 102 95 ° C con una retención de 15 s, enfriar a 60 ° C con una retención de 15 s, y calentar a 72 ° C con un mantenimiento de 15 s. 

3.     A continuación, se llevó a cabo un análisis de la curva de fusión LightCycler con una velocidad de calentamiento de 0,2 ° C / s comenzando a 50 ° C. Los valores de fluorescencia de cada capilar se midieron a 640 nm.  El análisis de los datos se realizó con el software LightCycler y se empleó el método de puntos de ajuste para calcular los valores del ciclo de cuantificación (Cq). 

4.     En varios experimentos, los resultados de la PCR en tiempo real se confirmaron posteriormente mediante electroforesis en gel de agarosa estándar y tinción con bromuro de etidio. 

5.      Cada  ensayo de qPCR incluyó un control negativo sin molde y uno positivo. Se utilizaron con hisopos ambientales (5 μl de la muestra negativa mezclada con 2 pg de control positivo en un tubo separado) para confirmar los resultados negativos. 

RESULTADOS:

Se pudo realizar una inmediata no detección del parásito, ya que los resultados para la cepa Hankow dieron negativos. Por lo que se recomienda hacer la misma experimentación en otro paciente que sí pueda tener el parásito.
Además, se analizó que la combinación de las muestras de PCR e hibridación se puede utilizar en otros ensayos de qPCR dirigidos a genes de virulencia codificados por plásmidos, para confirmar la identidad y patogenicidad de cualquier muestra sospechosa de ántrax. 

REFERENCIA DEL ARTÍCULO MÉDICO.

.- Bassy, O. Jiménez O. et. Rapid identification of Bacillus anthracis by real-time PCR with dual hybridization probes in environmental swabs. ELSEVIER. [Internet]. Volumen 17, February 2018, Pages 22-27. Referenciado el 24 de diciembre de 2021, de https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0890850817301044