Micromatrices de proteínas del genoma completo para el perfilado sérico de antígenos inmunodominantes de Bacillus anthracis
1.- Los ProtoArrays se equilibraron a 5 °C, luego se rehidrataron , y se aseguró la cobertura en un portaobjetos sellado. 2.-El tampón se aspiró y se agregaron 15 ml de agua diluida y suero añadido; se incubaron a 4◦C durante 90 min. 3.-Luego, los portaobjetos se hibridaron con dos anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a una dilución de 1/1000 durante 45 min, IgG-Cy3 antihumano de cabra e IgA antihumano de cabra. 4.-Se escanearon con un escáner de microarrays GenePix Pro 4200A. Las señales fluorescentes de cada canal (Cy3 y Cy5) se cuantificaron para su análisis utilizando el software de cuantificación de microarrays Bluefuse™.
Resultados: En resumen, Anthrax ProtoArray ha identificado muchas proteínas inmunogénicas. Sin embargo, el reconocimiento general de las proteínas del ántrax fue algo más reducido de lo esperado en los grupos desafiados en comparación con los controles ingenuos.
Bibliografía: Kempsell K, Kidd S, Lewandowski K, et. Whole genome protein microarrays for serum profiling of immunodominant antigens of Bacillus anthracis. Pubmed. [Internet].
1. Se desarrollaron cebadores para la amplificación de un fragmento de 235 pb de la
secuencia E4. Las sondas de hibridación dual se diseñaron con el software
LightCycler Probe Design para evitar procedimientos de post-amplificación que
consumen mucho tiempo. Las mezclas de amplificación contenían 2 μl de la mezcla
10X LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes, 3 mM de MgCl2
(concentración final), 0.5 μM de cada oligonucleótido, 0,25 μM de cada sonda de
hibridación y 5 μl de ADN molde en un volumen final de 20 μl.
2. Después de una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min para activar la
ADN polimerasa FastStart Taq, el perfil de amplificación de 45 ciclos consistió en
calentar a 102 95 ° C con una retención de 15 s, enfriar a 60 ° C con una retención
de 15 s, y calentar a 72 ° C con un mantenimiento de 15 s.
3. A continuación, se llevó a cabo un análisis de la curva de fusión LightCycler con una
velocidad de calentamiento de 0,2 ° C / s comenzando a 50 ° C. Los valores de
fluorescencia de cada capilar se midieron a 640 nm. El análisis de los datos se
realizó con el software LightCycler y se empleó el método de puntos de ajuste para
calcular los valores del ciclo de cuantificación (Cq).
4. En varios experimentos, los resultados de la PCR en tiempo real se confirmaron
posteriormente mediante electroforesis en gel de agarosa estándar y tinción con
bromuro de etidio.
5. Cada ensayo de qPCR incluyó un control negativo sin molde y uno positivo. Se utilizaron con hisopos ambientales (5 μl de la muestra negativa mezclada con 2 pg de control
positivo en un tubo separado) para confirmar los resultados negativos.
RESULTADOS:
Se pudo realizar una inmediata no detección del parásito, ya que los resultados para la
cepa Hankow dieron negativos. Por lo que se recomienda hacer la misma experimentación
en otro paciente que sí pueda tener el parásito.
Además, se analizó que la combinación de las muestras de PCR e hibridación se puede
utilizar en otros ensayos de qPCR dirigidos a genes de virulencia codificados por
plásmidos, para confirmar la identidad y patogenicidad de cualquier muestra sospechosa
de ántrax.
REFERENCIA DEL ARTÍCULO MÉDICO.
.- Bassy, O. Jiménez O. et. Rapid identification of Bacillus anthracis by real-time PCR with dual hybridization probes in environmental swabs. ELSEVIER. [Internet]. Volumen 17, February 2018, Pages 22-27. Referenciado el 24 de diciembre de 2021, de https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0890850817301044
Las muestras utilizadas incluyen: sangre humana, saliva, esputo, hisopos nasales, orina y tejidos vegetales.
1. Lisis: Se realiza para la conservación del ADN, contienen ácido etilendiaminotetraacético, que forma un
complejo con los iones de magnesio, e impide el funcionamiento de las desoxirribunucleasas.
2. Separación: se separa el ADN de las proteínas y lípidos; la tendencia
hidrofílica de los grupos fosfato los separan en medios acuosos, mientras
que las proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos.
3. Centrifugación: Se aísla el ADN; se suele usar: fenol, cloroformo y alcohol isoamílico, aunque estos contaminan fácilmente el ADN, por lo que se evita en el
proceso de purificación.
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA:
*Rajesh, P. Ostermann, E. Wei, Q. Advances in point-of-care nucleic acid extraction technologies for rapid diagnosis of human and plant diseases. Pubmed. [Internet].
1. Mantener los valores de respeto con todos los materiales a manipular y con las personas a tratar, tal es el caso del área de cultivos, donde se debe entrar estrictamente solo las personas quienes lo realicen, por ello la puerta corrediza siempre deberá permanecer cerrada.
2. Abstenerse de realizar actividades ajenas a la prácticas, tales como: fumar, comer, maquillarse, etc.
3. Considerar con mayor cautela la higiene y el aseo en todo momento; esto incluye la utilización correcta de la vestimenta, mandil, guantes, gafas, gorro, zapatos adecuados.
-Aquí les dejo una bibliografía muy interesante para profundizar en el tema, espero y os guste!.
.-Hemming, D. Macneill, K. Use of meteorological data in biosecurity. 2020 Dec 15[Internet] 15;4(5):497-511. doi:10.1042/ETLS20200078. Referenciado el 07 de diciembre de 2021. Recuperado de: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32935835/
.- Byers, C. Biosecurity measures in clinical practice. 2020 Aug 20[Internet]. 50(6):1277-1287, doi: 101016/j.cvsm.2020.07.004.Epub. Referenciado el 07 de diciembre de 2021. Recuperado de: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32829951/
Es un honor referirme a ustedes, soy su nueva alumna y compañera Belén Guevara; ansiosa de iniciar un nuevo semestre y con la mayor predisposición posible hacia la materia de biología molecular, aspiro aprender y crecer en este nuevo ámbito.
Les deseo a todos las más cordiales bienvenidas, espero llevarnos muy bien.
